Click™ EdU Andy Fluor™ 555 Imaging Kit (EdU 法细胞增殖（细胞成像）检测试剂盒)，储存条件： -20℃，避光保存。
| 产品货号 | 组份 | 试剂名称 | 包装 | 浓度 | 储存条件 |
| A0003 | 组份 A | EdU | 2×1 ml | 10 mM in DMSO | -20℃ |
| 组份 B | Andy Fluor 555 azide | 100 μl | NA | 避光 -20℃ |
| 组份 C | iClick EdU reaction buffer | 50 ml | 1× | 2-8°C |
| 组份 D | CuSO4 | 1 ml | 10 mM in H2O | -20℃ |
| 组份 E | iClick EdU buffer additive | 200 mg | NA | -20℃ |
| 组份 F | Hoechst33342 | 70 µl | 5 mM in H2O | -20℃ |
注：按照推荐的储存条件保存有效期为 1 年，请注意避免反复冻融。
激发/发射波长：Andy Fluor 555 azide:555/565nm；Hoechst 33342:350/461nm。
实验所需耗材（不包含在试剂盒中）
- 1×PBS（pH 7.2~7.6）
- 细胞固定液（含 3.7%甲醛的 PBS）
- 细胞透膜液（含 0.5%Triton®X-100 的 PBS）
- 含 3% BSA 的 PBS（pH 7.4）
- 去离子水
- 18×18 mm 盖玻片
注意事项
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、试剂盒说明
直接测定 DNA 合成是细胞增殖检测的最准确方法之一，是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法，其中以前常用的方式是利用胸腺嘧啶核苷酸类似物-BrdU进行检测。因为在细胞周期的S 期，和细胞一起孵育的BrdU能掺入DNA 分子中，再结合 BrdU 抗体与掺入 DNA 的 BrdU 特异性结合，就能够检测到 DNA 复制活跃的细胞。但 BrdU 有一大缺点，就是需要变性 DNA 后才能与抗体结合，但这就破坏了 DNA 双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性 降低等问题。
iClick™EdUAndyFluor555 细胞增殖（细胞成像）检测试剂盒采用 EdU 对细胞做标记用于细胞增殖检测。EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷酸类似物，在细胞增殖时 EdU 能够掺入正在复制的 DNA 分子中，检测是基于一种点击化学（ClickChemistry）反应：铜催化的叠氮和炔的共轭结合。利用 EdU 与染料之间的点击化学反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析，可以有效地检测处于 S 期的细胞百分数。
与传统的免疫荧光染色（BrdU）检测方法相比，更简单，更快速，更准确。EdU 只有 BrdU 抗体大小的 1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性（酸解、热解、酶解）处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。
二、 实验步骤
1. EdU 标记
注意：EdU 标记的最佳浓度根据细胞类型而变化。建议使用 EdU 的起始浓度为 10 μM。细胞培养基，细胞浓度，细胞类型及其它因素都可能影响标记 EdU 标记效率。所以，在进行初始实 验时，要先根据自身的细胞类型和实验条件，选用几组不同的 EdU 浓度来确定最佳的 EdU 浓度。
1.1 以合适的细胞浓度，将细胞铺到盖玻片上，将细胞培养过夜至正常生长阶段。
1.2 制备 2×EdU 工作液。用细胞培养基按一定比例稀释 EdU 溶液（组份 A）。 建议使用 10 μM EdU 初始浓度。
1.3 预热 2×EdU 工作液到 37℃，往含培养基的细胞中加入等体积的 2×EdU 工作液。例如实验选用EdU的终浓度为10μM，配置20μMEdU工作液并用20μM EdU 工作液取代一半的细胞培养基。我们不建议去除所有的细胞培养基后直接加入 1× EdU 工作液。因为这样操作会影响细胞正常生长。
1.4 根据细胞类型孵育一段时间，最佳孵育时间与细胞周期相关，大多数肿瘤细胞 可采用 2 小时孵育时间。不同细胞类型的孵育时间可参考如下表 1。
表 1：EdU 孵育时间参考表
| 细胞类型 | 人胚胎细胞 | 酵母细胞 | 人成纤维细胞 | 人宫颈癌细胞 | 人胚肾细胞 | 人神经细胞 |
| 细胞周期 | ~30 min | ~3 h | ~18 h | ~21 h | ~25 h | ~5 d |
| 孵育时间 | 5 min | 20 min | 2 h | 2 h | 2 h | 1 d |
2. 细胞固定、透膜处理
注意：本实验操作采用含 3.7%甲醛的 PBS 进行细胞固定，含 0.5% Triton X-100 的 PBS 进行细胞透膜处理。但是，其它的细胞固定及透膜方法比如甲醇、皂素等同样适用于本实验操作。
2.1 移除细胞培养液，往含盖玻片的多孔板里每孔加入 1 ml 细胞固定液（含 3.7% 甲醛的 PBS ），室温孵育 15 分钟。
2.2 移除细胞固定液，每孔加入 1 ml 含 3% BSA 的 PBS 清洗细胞 5 分钟，重复一次。
2.3 移除细胞清洗液，每孔加入 1ml 细胞透膜液（含 0.5%TritonX-100 的 PBS ），室温孵育 20 分钟。
3. EdU 检测
注意：本实验操作采用 100μliClick 反应液体系，也可按实际需求使用更大或更小体积的 iClick 反应液体系，但须保证配置的反应液中各试剂组份保持同一个比例。
3.1 配制 10×iClickEdU 缓冲添加剂。取试剂盒组份 E，加入 1ml 去离子水，颠倒混匀直到溶质完全溶解。使用后建议储存剩余的缓冲添加剂于-20℃或更低温度，可以稳定保存至少 1 年以上。如果溶液变成棕黄色，说明该试剂发生降解，则需更换。
3.2 配制 1×iClickEdU 缓冲添加剂。用去离子水做 10 倍稀释 10×iClickEdU 缓冲添加剂。现用现配。
3.3 配制 1×iClick 反应液体系，按照如下表 2 的顺序依次配制，否则无法达到最佳的使用效果。注意反应液体系需在 15 分钟之内使用。
表 2：1× iClick 反应液体系配制参考
| 试剂 | 盖玻片数量 |
| 5 | 10 | 20 | 50 |
| iClick EdU reaction buffer（组份 C） | 430 μl | 860 μl | 1.8 ml | 4.3 ml |
| CuSO4（组份 D） | 20 μl | 40 μl | 80 μl | 200 μl |
| Andy Fluor555 azide（组份 B） | 1.5 μl | 3 μl | 6 μl | 15 μl |
| 1× iClickEdU 缓冲添加剂（步骤 3.2） | 50 μl | 100 μl | 200 μl | 500 μl |
| 总体积 | 500 μl | 1 ml | 2 ml | 5 ml |
3.4 移除细胞透膜液，每孔加入 1 ml 含 3% BSA 的 PBS 清洗细胞 5 分钟，重复一次。移除细胞清洗液。
3.5 每孔加入 100 μl iClick 反应液。确保 iClick 反应液均匀覆盖整个盖玻片。
3.6 室温孵育 30 分钟，注意避光。
3.7 移除 iClick 反应液，每孔加入 1 ml 含 3% BSA 的 PBS 清洗细胞 5 分钟，重复1~2 次。移除细胞清洗液。
注意：某些细胞对染料的吸附性较强，会导致较高的背景信号，为降低染料背景信号，可采用甲醇清洗 1~2 次，每次 5 分钟。然后用含 3% BSA 的 PBS 清洗 5 分钟。
如需做细胞核复染，请按 DNA 染色步骤操作。如不需要额外的染色，即可将上述盖玻片封片后直接在荧光显微镜观察及成像分析。
4. DNA 染色
4.1 每孔加入 1 ml PBS 清洗细胞，移除细胞清洗液。
4.2 配置 1×Hoechst33342 染色液。取出试剂盒组份试剂 F，使用 PBS 按 1:1000 比例稀释。1×Hoechst 33342 染色液的终浓度为 5 μg/ml。
4.3 每孔加入 200μl 1×Hoechst33342 染色液。室温孵育 15 分钟，注意避光。移除 Hoechst 33342 染色液。
4.4 每孔加入 1 ml PBS 清洗细胞 5 分钟，重复一次。移除细胞清洗液。
5. 成像及分析
将盖玻片晾干后，用封闭液在载玻片上封片，盖玻片四周用指甲油密封。根据如下 表 3 染料的荧光激发和发射波长选择合适的激发光源和滤光片，荧光显微镜观察。
表 3：荧光染料激发/发射波长
| 荧光探针 | 激发波长（nm） | 发射波长（nm） |
| Andy Fluor 555 azide | 555 | 565 |
| Hoechst 33342 | 350 | 461 |
三、实验案例
图1.iClick™ EdU Andy Fluor555细胞增殖检测试剂盒检测A549细胞增殖的细胞成像分析结果图。
使用10μM EdU处理 A549细胞2小时，然后使用Andy Fluor™ 555 Azide（绿色荧光）进行点击化学反应检测细胞增殖情况，Hoechst 33342（蓝色荧光）进行细胞核复染。
