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    慢病毒纯化
    慢病毒检测
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    基因敲入
    基因分型
  • 细胞生物学
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    蛋白质检测
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    磷酸化Elisa
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    生化试剂
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    采血针
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    搅拌机/器
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    GenecopoeiaRaybiotechABGENTAbmole
    Genecopoeia
    Raybiotech
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    抗体芯片
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    糖化芯片
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    功能检测试剂盒
    ABGENT
    单克隆抗体
    多克隆抗体
    Abmole
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    细胞因子
    抑制剂/激动剂
    荧光染料
产品详情
iClick™ EdU Andy Fluor™ 488 Imaging Kit  Edu细胞增殖检测试剂盒 
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编号: A003 规格: 250次
品牌: GeneCopoeia 货期: 现货

Click™ EdU Andy Fluor™ 488 Imaging Kit (EdU 法细胞增殖(细胞成像)检测试剂盒),储存条件: -20℃,避光保存。


产品货号组份试剂名称包装浓度储存条件
A0003组份 AEdU2×1 ml10 mM in DMSO-20℃
组份 BAndy Fluor 488 azide100 μlNA避光 -20℃
组份 CiClick EdU reaction buffer50 ml2-8°C
组份 DCuSO41 ml10 mM in H2O-20℃
组份 EiClick EdU buffer additive200 mgNA-20℃
组份 FHoechst3334270 µl5 mM in H2O-20℃

注:按照推荐的储存条件保存有效期为 1 年,请注意避免反复冻融。


激发/发射波长:Andy Fluor 488 azide:495/520nm;Hoechst 33342:350/461nm。


实验所需耗材(不包含在试剂盒中)

  • 1×PBS(pH 7.2~7.6)
  • 细胞固定液(含 3.7%甲醛的 PBS)
  • 细胞透膜液(含 0.5%Triton®X-100 的 PBS)
  • 含 3% BSA 的 PBS(pH 7.4)
  • 去离子水
  • 18×18 mm 盖玻片

注意事项

  • 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
  • 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、试剂盒说明

直接测定 DNA 合成是细胞增殖检测的最准确方法之一,是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法,其中以前常用的方式是利用胸腺嘧啶核苷酸类似物-BrdU进行检测。因为在细胞周期的S 期,和细胞一起孵育的BrdU能掺入DNA 分子中,再结合 BrdU 抗体与掺入DNA 的 BrdU 特异性结合,就能够检测到 DNA 复制活跃的细胞。但 BrdU 有一大缺点,就是需要变性 DNA 后才能与抗体结合,但这就破坏了 DNA 双链结构,影响了其他染料的结合染色,导致染色弥散,准确性降低等问题。


iClick™EdUAndyFluor488 细胞增殖(细胞成像)检测试剂盒采用 EdU 对细胞做标记用于细胞增殖检测。EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷酸类似物,在细胞增殖时 EdU 能够掺入正在复制的 DNA 分子中,检测是基于一种点击化学(ClickChemistry)反应:铜催化的叠氮和炔的共轭结合。利用 EdU 与染料之间的点击化学反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析,可以有效地检测处于 S 期的细胞百分数。


与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比,更简单,更快速,更准确。EdU 只有 BrdU 抗体大小的 1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。


二、 实验步骤

1. EdU 标记


注意:EdU 标记的最佳浓度根据细胞类型而变化。建议使用 EdU 的起始浓度为 10 μM。细胞培养基,细胞浓度,细胞类型及其它因素都可能影响标记 EdU 标记效率。所以,在进行初始实 验时,要先根据自身的细胞类型和实验条件,选用几组不同的 EdU 浓度来确定最佳的 EdU 浓度。


1.1 以合适的细胞浓度,将细胞铺到盖玻片上,将细胞培养过夜至正常生长阶段。

1.2 制备 2×EdU 工作液。用细胞培养基按一定比例稀释 EdU 溶液(组份 A)。 建议使用 10 μM EdU 初始浓度。

1.3 预热 2×EdU 工作液到 37℃,往含培养基的细胞中加入等体积的 2×EdU 工作 液。例如实验选用EdU的终浓度为10μM,配置20μMEdU工作液并用20μMEdU 工作液取代一半的细胞培养基。我们不建议去除所有的细胞培养基后直接加入 1× EdU 工作液。因为这样操作会影响细胞正常生长。

1.4 根据细胞类型孵育一段时间,最佳孵育时间与细胞周期相关,大多数肿瘤细胞 可采用 2 小时孵育时间。不同细胞类型的孵育时间可参考如下表 1。


表 1:EdU 孵育时间参考表

细胞类型人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞人神经细胞
细胞周期~30 min~3 h~18 h~21 h~25 h~5 d
孵育时间5 min20 min2 h2 h2 h1 d


2. 细胞固定、透膜处理


注意:本实验操作采用含 3.7%甲醛的 PBS 进行细胞固定,含 0.5% Triton X-100 的 PBS 进行细胞透膜处理。但是,其它的细胞固定及透膜方法比如甲醇、皂素等同样适用于本实验操作。


2.1 移除细胞培养液,往含盖玻片的多孔板里每孔加入 1 ml 细胞固定液(含 3.7% 甲醛的 PBS ),室温孵育 15 分钟。

2.2 移除细胞固定液,每孔加入 1 ml 含 3% BSA 的 PBS 清洗细胞 5 分钟,重复一 次。

2.3 移除细胞清洗液,每孔加入 1ml 细胞透膜液(含 0.5%TritonX-100 的 PBS ),室温孵育 20 分钟。


3. EdU 检测


注意:本实验操作采用 100μliClick 反应液体系,也可按实际需求使用更大或更小体积的 iClick 反应液体系,但须保证配置的反应液中各试剂组份保持同一个比例。


3.1 配制 10×iClickEdU 缓冲添加剂。取试剂盒组份 E,加入 1ml 去离子水,颠倒混匀直到溶质完全溶解。使用后建议储存剩余的缓冲添加剂于-20℃或更低温度,可以稳定保存至少 1 年以上。如果溶液变成棕黄色,说明该试剂发生降解,则需更换。

3.2 配制 1×iClickEdU 缓冲添加剂。用去离子水做 10 倍稀释 10×iClickEdU 缓冲添加剂。现用现配。

3.3 配制 1×iClick 反应液体系,按照如下表 2 的顺序依次配制,否则无法达到最佳的使用效果。注意反应液体系需在 15 分钟之内使用。

表 2:1× iClick 反应液体系配制参考

试剂盖玻片数量
5102050
iClickEdUreaction buffer(组份 C)430 μl860 μl1.8 ml4.3 ml
CuSO4(组份 D)20 μl40 μl80 μl200 μl
Andy Fluor488azide(组份 B)1.5 μl3 μl6 μl15 μl
1× iClickEdU 缓冲添加剂(步骤 3.2)50 μl100 μl200 μl500 μl
总体积500 μl1 ml2 ml5 ml


3.4 移除细胞透膜液,每孔加入 1 ml 含 3% BSA 的 PBS 清洗细胞 5 分钟,重复一次。移除细胞清洗液。

3.5 每孔加入 100 μl iClick 反应液。确保 iClick 反应液均匀覆盖整个盖玻片。

3.6 室温孵育 30 分钟,注意避光。

3.7 移除 iClick 反应液,每孔加入 1 ml 含 3% BSA 的 PBS 清洗细胞 5 分钟,重复1~2 次。移除细胞清洗液。


注意:某些细胞对染料的吸附性较强,会导致较高的背景信号,为降低染料背景信号,可采用甲醇清洗 1~2 次,每次 5 分钟。然后用含 3% BSA 的 PBS 清洗 5 分钟。


如需做细胞核复染,请按 DNA 染色步骤操作。如不需要额外的染色,即可将上述盖玻片封片后直接在荧光显微镜观察及成像分析。


4. DNA 染色


4.1 每孔加入 1 ml PBS 清洗细胞,移除细胞清洗液。

4.2 配置 1×Hoechst33342 染色液。取出试剂盒组份试剂 F,使用 PBS 按 1:1000 比例稀释。1×Hoechst 33342 染色液的终浓度为 5 μg/ml。

4.3 每孔加入 200μl 1×Hoechst33342 染色液。室温孵育 15 分钟,注意避光。移除 Hoechst 33342 染色液。

4.4 每孔加入 1 ml PBS 清洗细胞 5 分钟,重复一次。移除细胞清洗液。


5. 成像及分析


将盖玻片晾干后,用封闭液在载玻片上封片,盖玻片四周用指甲油密封。根据如下 表 3 染料的荧光激发和发射波长选择合适的激发光源和滤光片,荧光显微镜观察。


表 3:荧光染料激发/发射波长

荧光探针激发波长(nm)发射波长(nm)
Andy Fluor 488 azide495520
Hoechst 33342350461


三、实验案例

图1.iClick™ EdUAndyFluor488细胞增殖检测试剂盒检测A549细胞增殖的细胞成像分析结果图。

使用10μM EdU处理 A549细胞2小时,然后使用Andy Fluor™ 488Azide(绿色荧光)进行点击化学反应检测细胞增殖情况,Hoechst 33342(蓝色荧光)进行细胞核复染。



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