eGFP Annexin V and PI Apoptosis Kit (细胞凋亡检测试剂盒)
| 产品货号 | 组份 | 试剂名称 | 包装 | 储存条件 |
| A025 | 组份 A | eGFP Annexin V | 500 μl | 避光 2-6°C |
| 组份 B | PI | 200 μl | 避光 2-6°C |
| 组份 C | 5×Annexin-binding buffer | 50 ml | 2-6°C |
注：按照推荐的储存条件保存有效期为 1 年，请注意不要冷冻保存。
激发/发射波长：eGFP：475/509 nm；PI：535/617 nm。
实验所需耗材（不包含在试剂盒中）
- 1×PBS（pH 7.2~7.6）
- 去离子水
- 诱导剂
- 18×18 mm 盖玻片
注意事项
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、试剂盒说明
细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它是细胞正常生理活动的一部分。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS） 只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸 （PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为 35~36 kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 AnnexinV 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行荧光素（eGFP, FITC,Andy Fluor）或生 物素标记，以标记了的 AnnexinV 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
eGFPAnnexin V/ PI 细胞凋亡检测试剂盒提供了一种快速、方便分析细胞凋亡的方法。本试剂盒包括含 eGFP 标签的 Annexin V 用于检测早期凋亡细胞，和即用型的核酸染料 PI 用于检测晚期凋亡细胞和死细胞。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种红色核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡晚期的 细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此，将 Annexin V 与 PI 联合使用时，就可以将处于不同凋亡时期的细胞和死细胞区分开来。
二、 实验步骤
样品染色
1． a) 悬浮细胞：300×g，4℃离心 5 min 收集细胞。
b) 贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后，300×g，4℃离心 5 min 收集细胞。（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性
2． 准备阳性实验对照组，使用合适的方法诱导细胞凋亡。同时准备未经凋亡诱导处理的细胞作为阴性实验对照组。
3． 用 4℃预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次均需 300×g，4℃离心 5 min
4． 配制 1×Annexin-binding buffer：用去离子水按 1:5 稀释 5×Annexin-binding buffer（组份 C）（2ml 5×Annexin-binding buffer +8ml 去离子水）
5． 用 1×Annexin-binding buffer 重悬细胞，调节其浓度为~1×106细胞/ml。
6． 取 100 µl 细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5 µl eGFPAnnexin V（组份 A）和 1~2 µl PI（组份 B），轻轻混匀。
7． 室温、避光、反应 15 min。
8． 加入 400 µl 1×Annexin-binding buffer，轻柔混匀，冰上放置。
9． 请在 1 小时内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
荧光显微镜观察
1．用 1×Annexin-binding buffer 洗涤细胞，300×g，4℃离心 5 min。然后用 1×Annexin-binding buffer 重悬细胞。
2．滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
3．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡。
（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组。
（2） 用 PBS 洗涤细胞两次。
（3） 在 100µl1×Annexin-bindingbuffer 中加入 5~25µleGFPAnnexinV， 2 µl Propidium Iodide 混匀。
（4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖。
（5） 避光、室温反应 5~15 min。
（6） 用 1×Annexin-binding buffer 洗涤细胞两次。
4．将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC 和罗丹明） 观察 eGFPAnnexin V 荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。
流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测，激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=530 nm。
eGFPAnnexinV 绿色荧光通过 FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过 PI 通 道（FL2 或 FL3）检测。
荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节 去除光谱重迭和设定十字门的位置。
三、实验案例
使用 10 μM 喜树碱处理 Jurkat 细胞 4 小时作为阳性实验组，同时设置未处理组 做阴性对照。使用 eGFPAnnexin V/ PI 细胞凋亡检测试剂盒的实验操作说明对 以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。结果显示，阳性实验 组（右图）相比对照组（左图） ，获得更高的凋亡细胞数量。A：代表凋亡细胞； V：代表活细胞；N：代表死亡细胞。
