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    生化试剂
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    培养皿
    培养瓶
    其他
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    细胞因子
    抑制剂/激动剂
    荧光染料
产品详情
eGFP Annexin V and PI Apoptosis Kit 细胞凋亡检测试剂盒 
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编号: A025 规格: 100次
品牌: GeneCopoeia 货期: 现货

eGFP Annexin V and PI Apoptosis Kit (细胞凋亡检测试剂盒)


产品货号组份试剂名称包装储存条件
A025组份 AeGFP Annexin V500 μl避光 2-6°C
组份 BPI200 μl避光 2-6°C
组份 C5×Annexin-binding buffer50 ml2-6°C

注:按照推荐的储存条件保存有效期为 1 年,请注意不要冷冻保存。


激发/发射波长:eGFP:475/509 nm;PI:535/617 nm。


实验所需耗材(不包含在试剂盒中)

  • 1×PBS(pH 7.2~7.6)
  • 去离子水
  • 诱导剂
  • 18×18 mm 盖玻片

注意事项

  • 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
  • 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、试剂盒说明

细胞凋亡(apoptosis)指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它是细胞正常生理活动的一部分。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS) 只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸 (PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为 35~36 kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 AnnexinV 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行荧光素(eGFP, FITC,Andy Fluor)或生 物素标记,以标记了的 AnnexinV 作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。


eGFPAnnexin V/ PI 细胞凋亡检测试剂盒提供了一种快速、方便分析细胞凋亡的方法。本试剂盒包括含 eGFP 标签的 Annexin V 用于检测早期凋亡细胞,和即用型的核酸染料 PI 用于检测晚期凋亡细胞和死细胞。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种红色核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡晚期的 细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此,将 Annexin V 与 PI 联合使用时,就可以将处于不同凋亡时期的细胞和死细胞区分开来。


二、 实验步骤

样品染色

1. a) 悬浮细胞:300×g,4℃离心 5 min 收集细胞。

b) 贴壁细胞:用不含 EDTA 的胰酶消化后,300×g,4℃离心 5 min 收集细胞。(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性

2. 准备阳性实验对照组,使用合适的方法诱导细胞凋亡。同时准备未经凋亡诱导处理的细胞作为阴性实验对照组。

3. 用 4℃预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次,每次均需 300×g,4℃离心 5 min

4. 配制 1×Annexin-binding buffer:用去离子水按 1:5 稀释 5×Annexin-binding buffer(组份 C)(2ml 5×Annexin-binding buffer +8ml 去离子水)

5. 用 1×Annexin-binding buffer 重悬细胞,调节其浓度为~1×106细胞/ml。

6. 取 100 µl 细胞悬液于 5 ml 流式管中,加入 5 µl eGFPAnnexin V(组份 A)和 1~2 µl PI(组份 B),轻轻混匀。

7. 室温、避光、反应 15 min。

8. 加入 400 µl 1×Annexin-binding buffer,轻柔混匀,冰上放置。

9. 请在 1 小时内,进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。


荧光显微镜观察

1.用 1×Annexin-binding buffer 洗涤细胞,300×g,4℃离心 5 min。然后用 1×Annexin-binding buffer 重悬细胞。

2.滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。

3.对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡。

(1) 将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组。

(2) 用 PBS 洗涤细胞两次。

(3) 在 100µl1×Annexin-bindingbuffer 中加入 5~25µleGFPAnnexinV, 2 µl Propidium Iodide 混匀。

(4) 将上述溶液滴加于盖玻片表面,使盖玻片表面均匀覆盖。

(5) 避光、室温反应 5~15 min。

(6) 用 1×Annexin-binding buffer 洗涤细胞两次。

4.将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下、双色滤光片(FITC 和罗丹明) 观察 eGFPAnnexin V 荧光信号呈绿色,PI 荧光信号呈红色。


流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测,激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=530 nm。

eGFPAnnexinV 绿色荧光通过 FITC 通道(FL1)检测;PI 红色荧光通过 PI 通 道(FL2 或 FL3)检测。

荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节 去除光谱重迭和设定十字门的位置。


三、实验案例

使用 10 μM 喜树碱处理 Jurkat 细胞 4 小时作为阳性实验组,同时设置未处理组 做阴性对照。使用 eGFPAnnexin V/ PI 细胞凋亡检测试剂盒的实验操作说明对 以上两组细胞进行相应的实验处理,流式细胞仪进行观察。结果显示,阳性实验 组(右图)相比对照组(左图) ,获得更高的凋亡细胞数量。A:代表凋亡细胞; V:代表活细胞;N:代表死亡细胞。


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