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RayBiotech抗体芯片在乳头状甲状腺癌恶化机制研究的应用

作者:Raybio浏览数:98 


杂志名称:Cell Death and Disease


文献题目:Yu, Shi-Tong, et al. "CRLF1 promotes malignant phenotypes of papillary thyroid carcinoma by activating the MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways." Cell death & disease 9.3 (2018): 371.


第一作者:Shi-Tong Yu


通讯作者:Mu-Sheng Zeng、Xiao-Ming Huang

作者单位:Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, 107 Yanjiang West Road, Guangzhou, 510120, China


本实验所用产品:AAH-MAPK-1(人MAPK磷酸化信号通路芯片)


实验样品:乳头状甲状腺癌组织

研究背景:

  乳头状甲状腺癌(PTC)是最普遍的内分泌癌症,是甲状腺癌近十年中发病率最高的类型。PTC通常可被治愈,5年生存率>95%,但在某些病例中,PTC去分化且伴有侵略性。近期研究表明,遗传学变化可通过MAPK/ERK和PI3K/AKT通路促进肿瘤增殖和转移,导致不良预后。对不良预后患者表达的基因进行基因图谱分析,发现细胞因子受体样因子(CRLF1)在癌组织中有较大的变化,可作为PTC治疗的潜在靶点。CRLF1是一种分泌蛋白,属于细胞因子受体家族,虽然已有报道CRLF1能促进神经细胞生长和存活,但对其功能机制尚未明确。本文探究CRLF1在PTC中的表达和其在PTC中的主要功能与分子机制。


1 结果

1.1 生物信息学分析说明CRLF1可作为PTC的候选靶点基因

  为区分出PTC中潜在的肿瘤相关基因,生物信息软件分析TCGA数据,发现了197个候选基因。取PTC组织通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证,发现CRLF1 mRNA和CRLF1蛋白表达水平明显偏高。(图a)对不同细胞系(TPC-1、 IHH-4、 B-CPAP、8305C 、SW579、Nthy-ori 3-1)进行qRT-PCR和免疫印迹(WB),发现CRLF1 mRNA和蛋白只在B-CPAP (PTC细胞系)和 8305C (甲状腺未分化癌) 表达(图d)。表明CRLF1高表达于PTC,尤其是那些伴有淋巴结转移或癌症晚期的患者中。

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1.2 CRLF1高表达与侵略性临床病理特征和低生存率有关

  为了进一步研究CRLF1表达量和癌症临床病理特征的相关性,免疫组化分析201份PTC切片样本。结果表明,有83个样本(41.3%)高表达CRLF1,高表达CRLF1与肿瘤大小、甲状腺外扩散、T期、N期和临床期有关(表1)。将病患分为两个组(I/II期和 III/IV期),发现高表达CRLF1的患者样品伴有较差的疾病生存率(DFS)(图d/e)结果说明,CRLF1表达水平与低生存率有关,CRLF1蛋白表达量对PTC有重要的预后作用。

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1.3 CRLF1促进PTC细胞增殖

  通过对CRLF1基因进行功能获得型(突变)和功能缺失型(突变)实验,探究CRLF1的作用。B-CPAP细胞中CRLF1经siRNAs (si-1#和si-2#)处理后被抑制,B-CPAP细胞增殖速率和克隆形成能力低于对照组(si-NC)。将超表达的CRLF1的TPC-1细胞系(低表达CRLF1)中,发现CRLF1异常表达增强细胞增殖能力(图f/g)。评估CRLF1对体内肿瘤生长的作用效果, CRLF1超表达的IHH-4 细胞,细胞生长更快且面积更大(图h)。结果说明CRLF1促进肿瘤体外和体内增殖。

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1.4 CRLF1促进PTC细胞迁移和侵入并诱导上皮间质转化

     由于CRLF1表达水平与N期和M期有关,我们进一步研究CRLF1是否影响B-CPAP 细胞迁移能力和侵入能力,结果转染si-CRLF1-1#或 si-CRLF1-2#的细胞迁移能力明显低于si-NC组,说明CRLF1提高PTC细胞的迁移能力和侵入能力。TPC-1和IHH-4细胞中CRLF1异常表达能促进迁移和侵入,说明CRLF1能增强PTC细胞的迁移能力和侵入能力(图c)。实验研究CRLF1是否影响PTC细胞的上皮间质转化(EMT),结果钙粘蛋白表达下调。间叶细胞标记物(波形蛋白、纤粘连蛋白)表达水平上调,证明CRLF1在PTC细胞中诱发EMT(图f)。CRLF1敲除抑制细胞生长入侵,进一步说明CRLF1可能促进PTC细胞恶性表型。

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1.5 CRLF1通过MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路调控致瘤

  为了确定CRLF1在PTC细胞中影响肿瘤形成的潜在机制,使用磷酸化信号检测芯片检测IHH-4细胞。在CRLF1超表达的IHH-4细胞中AKT (p-S473) 和 ERK1/2 (p-T202/Y204, p-Y185/Y187)磷酸化水平升高(图a)。WB分析,发现CRLF1可能激活JAK2和SHP2磷酸化,从而激活ERK1/2和AKT(pS473)磷酸化。在CRLF1超表达的IHH-4肿瘤细胞中p-ERK1/2和 p-AKT高表达。加入U0126 ( MEK 抑制剂) 和 MK-2206 ( AKT抑制剂),判断抑制剂是否可以影响IHH-4-CRLF1癌细胞的生长,结果ERK 和 AKT表达水平下调,说明CRLF1可能通过部分MAPK/ERK和 PI3K/AKT信号通路调控肿瘤形成(图d)

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结论

     在本文中,首先验证了CRLF1可以增强PTC癌细胞的浸润能力,导致不良预后,紧接着通过磷酸化信号检测芯片,发现了CRLF1异常表达可能激活JAK2和SHP2磷酸化,接着激活MAPK/ERK 和 PI3K/AKT信号通路调控肿瘤形成。本研究说明了CRLF1对癌细胞快速生长和克隆的重要作用,为进一步研究PTC有重要意义。


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