Raybiotech抗体芯片在白内障研究上的应用

杂志名称：Investigative ophthalmology & visual science

文献题目：Chowdhury U R, Madden B J, Charlesworth M C, et al. Proteome analysis of human aqueous humor[J]. Investigative ophthalmology & visual science, 2010, 51(10): 4921-4931.

第一作者：Chowdhury U R

作者单位：Department of Ophthalmology

本实验所用产品：Raybiotech  人 AAH-BLG-1 抗体芯片（507个炎症、趋化、生长、血管等细胞因子抗体芯片）、 人QAH-CHE-1 抗体芯片（定量检查40个趋化因子抗体芯片）

实验样品：白内障手术患者房水

研究背景：

　　房水是由睫状体产生然后通过瞳孔进入前房，再由前房角的小梁网排出眼球。大量研究表明房水中蛋白质的改变与眼部疾病的诊断和预后有关键作用。了解房水中蛋白质的正常生理作用有重要意义。而目前文献汇报关于房水蛋白的种类少于150种，有理由对房水蛋白种类及含量进行深入研究。本文旨在研究人房水的蛋白质成分。

1 结果

1.1 样品收集    

通过手术收集，患者都是除了白内障外没有其他眼部疾病，样品立刻液氮冷冻直至检测。共155例样本，每个样本的蛋白含量都在正常范围(100–500 ng/ml)。

1.2 nano-LC-ESI-MS/MS分析

85个样本分成三组，免疫耗竭去除白蛋白、转铁蛋白、Ig A、Ig G、抗胰蛋白酶等已知的高丰度蛋白，每份样品取20ug，干燥后等体积电泳缓冲液溶解，进行电泳分离，nano-LC-ESI-MS/MS进行分析。355个蛋白在质谱分析中被鉴定出来，其中鉴定出来的蛋白大部分是结构蛋白，酶或者有催化活性的蛋白质，355个蛋白中超过80%是hAH相关报道中没有出现过的蛋白，其中206个蛋白在三个组中都出现。

1.3. Western blot验证质谱结果

根据质谱分析结果，随机选取2个目标蛋白进行Westernblot验证，结果表明BigH3、Fibulin-3验证结果与质谱分析结果相符，而myocilin则是之前有报道表明hAH中含有该分子，在质谱分析中含有该结果，而WB验证结果相符。

1.4 抗体芯片分析

质谱分析的结果中只有少量的生长因子、趋化因子等，而低丰度蛋白没有检查出出来，为了检查出这些低丰度蛋白，选用21个样本分成4组进行芯片分析，选用AAH-BLG-1对507个炎症、趋化、生长、血管等细胞因子抗体芯片进行蛋白分析，328个蛋白被检测出来，其中217个蛋白是至少在3个组中都出现的。结果中有10个蛋白是质谱分析和抗体芯片分析中共有鉴定结果。

选用QAH-CHE-1定量检查10个独立样本中的趋化因子，结果表明通过抗体芯片检查出25个趋化因子，其蛋白浓度0.1~2.5ng/ml之间。

结论：

　　目前文献汇报关于房水蛋白的种类少于150种，大大制约了眼疾病的研究，而本研究利用质谱及抗体芯片分析，检查出676个蛋白，其中355蛋白通过质谱发现，其中超过80%都是没有在hAH相关研究中报道过的新蛋白。hAH中大量蛋白被发现，对眼疾病的研究及生物标志物的发现上起着重大作用。质谱鉴定出来的大多数蛋白都具有催化，酶和结果性质，而低丰度的生长因子类、趋化因子类蛋白检查少。利用抗体芯片分析出的328个蛋白质里有细胞因子，趋化因子，受体等，而定量的蛋白浓度介于0.1ng~2.5ng/ml间。10个蛋白被两个技术共同鉴定。本研究利用抗体芯片检查出大量质谱分析中不能检查的低丰度蛋白，并检查出其浓度，Raybiotech的抗体芯片在低丰度蛋白的检查中起着重要作用。