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RayBio抗体芯片在食管癌发生发展机制研究中的应用作者：Raybio浏览数:315次
杂志名称：Oncotarget 文献题目：Tian B, Chen X, Zhang H, et al. Urokinase plasminogen activator secreted by cancer-associated fibroblasts induces tumor progression via PI3K/AKT and ERK signaling in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017. 第一作者：田宝青 通讯作者：洪岸 作者单位：暨南大学，生物医药研究院细胞生物学系，广东省生物工程研究所 本实验所用产品：RayBio 人 AAH-BLG-1 抗体芯片（507个炎症、趋化、生长、血管等细胞因子抗体芯片） 实验样品：细胞培养上清 研究背景： 食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。其中鳞状食管癌又是其中最为常见的亚型。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤基质中成纤维细胞的活化形式，被认为是基质的主要细胞类型，其在肿瘤发生发展中起重要作用。寻找其发病机制对肿瘤治疗有关键作用，本文旨在了解CAFs在鳞状食管癌发生发展中的分子作用机制，为鳞状食管癌治疗提供新的思路。 1 分组 细胞样本：来源于食管鳞状细胞癌（ESCC）的肿瘤相关成纤维细胞（CAFs，n=2），正常成纤维细胞（NFs，n=2） 组织样本：食管鳞状细胞癌组织（n=26），配对癌旁组织（n=26） 2 结果 2.1 uPA在CAFs中表达量高于NFs 用蛋白芯片检测CAFs与NFs的培养基，43个上调，31个下调， uPA在CAFs中表达量为NFs的两倍，用ELISA进行验证（n=6）CAFs比NFs高7.26倍。qPCR检测两者uPA的mRNA表达量CAFs为NFs的5.28倍。
2.2 uPA在ESCC在原发性肿瘤组织中表达 为了找出uPA阳性细胞在原发性ESCC组织中的位置，选取了142个临床样本进行免疫组化检验，uPA阳性细胞位于肿瘤和基质组织之间，肿瘤巢间和肿瘤组织间的间质; 然而，uPA阳性细胞在相邻的非肿瘤食管组织中几乎检测不到。免疫荧光中也显示uPA阳性细胞为层纤维细胞，免疫组化结果也表明uPA在CAFs中表达不在NFs中表达。
2.3 PA基质表达与ESCC侵染和不良预后有关 免疫组化结果分析表明90%的原位ESCC病例（132/146）与ESCC基质中uPA阳性表达有关。基质中uPA表达与肿瘤侵染有关。生存曲线表明uPA阳性表达患者生存期明显比uPA阴性患者短(n = 132, median survival time 20 months)，uPA基质表达与ESCC预后呈负相关的关系。
2.4 CAFs分泌的uPA增强ESCC细胞的增殖与迁移 uPA蛋白和mRNA水平的增高都表白CAFs释放的uPA可能是通过旁分泌的途径调节ESCC。为了研究uPA在ESCC上的作用，选用EC109与KYSE30细胞进行研究，加入uPA或含有uPA的培养基。细胞用20ng/ml uPA或者CAFs培养基都能比用DMEM或NFs培养基更能促进细胞生长。加入中和uPA抗体后，增殖效果比用对照IgG的降低。这样的现象在迁移能力上有相同的结果。加入uPA中和抗体后，迁移效果下降。
2.5 CAFs分泌的uPA通过活化PI3K/AKT及ERK途径来对ESCC发展起作用 为了研究uPA在ESCC介导的信号通路，用20ng/ml的uPA处理EC109与KYSE30，结果表明PI3K, AKT, GSK3β, and ERK1/2. PI3K, AKT, GSK3β, and ERK1/2在10~30分钟内被激活.
为了进一步证实该作用，用PI3K抑制剂LY294002与MEK抑制剂U0126处理细胞30min后加入uPA或CAFs培养基，结果表明加入抑制剂或者抗uPA抗体后PI3K, AKT, GSK3β, and ERK1/2. PI3K, AKT, GSK3β, and ERK1/2磷酸化水平降低。在体外实验中，加入两种抑制剂后，细胞的增殖迁移能力比用uPA或CAFs培养基处理细胞要降低，然而抑制剂处理细胞与没有用uPA或CAFs培养基处理的细胞，细胞增殖、迁移能力没有明显改变。综合结果表明uPA促进ESCC迁移、增殖是依赖于PI3K/AKT、ERK信号通路的。
2.6 抑制uPA可抑制肿瘤在体内形成 移植瘤模型中，加入uPA抗体的实验组小鼠肿瘤的重量与提及均比对照IgG组的要小，肿瘤免疫组化结果也表明实验组中的AKT、ERK磷酸化水平降低，结果表明uPA介导的肿瘤生长可以通过阻断uPA来进行抑制。
3 结论 前期实验表明CAFs为刺激肿瘤发生发展提供了合适的肿瘤微环境，而在ECSS与CAFs的肿瘤微环境中是哪些分子起调控肿瘤发生发展起关键作用为ECSS的诊断、治疗以及预后有着重要的意义，本文通过使用RayBio的生物素标记法芯片检测临床样本，从507个蛋白中筛选出uPA，ELISA验证结果进一步证实芯片结果，在下游的体内外实验中显示了uPA在ESCC细胞侵染、增殖、迁移以及肿瘤生长发育有关键影响作用，而对其机制进行研究发现uPA起作用是通过PI3K/AKT、ERK信号通路起作用，uPA作用及其作用机制的发现，对ESCC的诊断、预后以及靶向治疗提供了重要依据RayBio蛋白芯片在其中起着关键作用！
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