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Raybiotech 抗体芯片在系统性红斑狼疮细胞衰老研究上的应用

作者:Raybio浏览数:236 


杂志名称:ARTHRITIS & RHEUMATOLOGY


文献题目:Chen H, Shi B, Feng X, et al. Leptin and Neutrophil‐Activating Peptide 2 Promote Mesenchymal Stem Cell Senescence Through Activation of the Phosphatidylinositol 3‐Kinase/Akt Pathway in Patients With Systemic Lupus Erythematosus[J]. Arthritis & rheumatology, 2015, 67(9): 2383-2393.


第一作者:Haifeng Chen


作者单位:The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing, China


本实验所用产品:Raybiotech人 AAH-CYT-G5 抗体芯片


实验样品:血清


研究背景:

细胞衰老(cell aging)是指细胞在执行生命活动过程中,随着时间的推移,细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。细胞的生命历程都要经过未分化、分化、生长、成熟、衰老和死亡几个阶段。衰老死亡的细胞被机体的免疫系统清除,同时新生的细胞也不断从相应的组织器官生成,以弥补衰老死亡的细胞。细胞衰老死亡与新生细胞生长的动态平衡时维持机体正常生命活动的基础。多种类型的环境压力可以诱导细胞发生衰老,包括氧化应激、致癌基因活化,缺乏营养或生长因子等。已有研究也表明IL-8NAP-2CXCR2可以显著增强细胞衰老,此外研究还表明该现象与JAK/STAT,Ras/Raf/MEK/ERK, NF-kB, PI3K/Akt 信号通路有关。间充质干细胞(MSC)是具有多分化潜能的成纤维细胞样粘附细胞以及有效的免疫调节细胞。已经研究显示来自患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者的MSC表现出功能不足,并且不能有效抑制TB淋巴细胞反应。相应地,同种异体MSC移植而不是自体狼疮MSC的移植可以改善疾病并减少蛋白尿。而来自SLE患者的骨髓来源的MSCBM-MSC)的细胞凋亡和衰老增加,但潜在的机制仍不清楚。但根据已有的研究可知该现象与微环境有重要联系,本研究旨在研究该潜在机制。


1 分组

SLS患者血清(n=5)、正常人血清(n=3)


2 结果

2.1 SLE患者血清能刺激MSCs衰老

为了检验SLE患者中分离的MSCs的衰老状态,检测了SA β-gal及p53\p21表达水平。结果表明SLE患者中的SA β-gal表达量比正常对照组明显升高。SLE患者的MSCs P53\p21的mRNA及蛋白水平都比正常对照组高,证明SLE患者的MSCs衰老水平比正常人高。脐带分离的MSCs(UC-MSCs)在功能及表象上与正常人MSCs相似,选取其SLE患者血清微环境研究对象。用正常人血清与SLE患者血清,分别对UC-MSCs进行培养,结果表明用SLE患者血清培养的MSCs其的SA β-gal表达量、P53\p21的mRNA及蛋白水平都比正常人血清培养的对照组高,结果表明SLE血清能够在体外促进MSCs衰老,且在SLE病人中MSCs衰老中起关键作用。

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2.2  SLE血清引起的MSCs衰老涉及到PI3K/AKT信号通路

JAK/STAT,Ras/Raf/MEK/ERK,NF-kB以及PI3K/AKT信号通路都被汇报与细胞衰老有关,而本研究中WB结果表明STAT-1,STAT-5,Akt,MEK,ERK-1/2的磷酸化水平都在用SLE患者血清处理后表达量上升,但STAT-3,Ras以及NF-KB的磷酸化水平却没有改变,结果表明本研究中与细胞衰老相关的通路可能为JAK/(STAT-1 and STAT-5),MEK/ERK或PI3K/Akt。为了明确具体涉及的信号通路,接下来用MEK/ERK抑制剂PD98059,JAK/STAT抑制剂AG490,以及PI3K/AKT抑制剂LY294002在用SLE患者血清处理前分别处理细胞。结果表明LY294002处理后SA β-gal阳性表达细胞数量减少,p53/p21 mRNA及蛋白表达水平下降,而用PD98059及AG490处理的细胞则没有明显变化,进一步说明SLE血清引起的MSCs衰老是通过PI3K/AKT信号通路进行的。

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2.3 抗体芯片筛选血清微环境中差异蛋白

为了研究SLE血清中引起MSCs衰老的因子,选用Raybiotech AAH-CYT-G5 检测80个人细胞因子的抗体芯片对5个SLS患者血清以及3个正常人血清进行检测,其中SLE血清中有12个蛋白比正常人血清表达量高且有显著性差异,其中差异最大的是leptin和NAP-2,为了验证该差异蛋白,选取24个SLE与12个正常血清进行ELISA验证,验证结果与抗体芯片结果相符。

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2.4 反向验证leptinNAP-2作用

为了验证leptin及NAP-2蛋白在SLE患者血清中的作用,实验中加入leptin和NAP-2的中和性抗体到SLE患者血清培养的的UC-MSCs。结果表明不管是加入leptin或者是NAP-2的中和性抗体后SLE血清引起的UC-MSCs衰老现象减少,SA β-gal阳性细胞数量及p53/p21的mRNA及蛋白表达水平都显著下调。

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2.5   leptinNAP-2引起的MSC衰老是通过PI3KAkt信号通路进行

阻断leptin及NAP-2后可以减少SLE血清引起的MSCs衰老,但其具体分子机制仍为清楚,下一步进行深入研究。实验结果表明UC-MSCs都有表达leptin受体及NAP-2受体CXCR2,但用正常人血清与SLE血清处理后的UC-MSCs表达量不同。单独用leptin或NAP-2刺激细胞其SA β-gal阳性细胞数量及p53/p21的mRNA及蛋白表达水平都表现上调,而两者共同刺激后这种现象更为显著。为了确定PI3K/Akt信号通路与leptin及NAP-2有关,WB检测Akt磷酸化水平与leptin及NAP-2有剂量效应关系,用PI3K/Akt抑制剂LY294002处理后,leptin及NAP-2引起的细胞衰老减少,p53/p21的mRNA及蛋白表达水平都表现下调。结果表明leptin、NAP-2引起的MSCs衰老现象是通过活化PI3K/AKT信号通路实现的。

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3 结论

本研究通过SLE血清与正常人血清培养MSCs细胞,发现两种血清培养的细胞细胞衰老情况显著不同,其中血清中的微环境尤为重要,用Raybiotech的抗体芯片发现leptin及NAP-2两个关键因子,并发现leptin及NAP-2促进MSCs衰老是通过PI3K/Akt信号通路实现的,而阻断leptin或NAP-2能够有助于恢复SLE患者的BM-MSC的功能,从而在SLE治疗中起作用,意义重大,Raybiotech的蛋白芯片在该研究中起关键作用。


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